Selasa, 10 Mei 2011

PENGAMBILAN, PENYIMPANAN DAN PENGIRIMAN SPESIMEN UNTUK PEMERIKSAAN INFEKSI DENGUE (DBD)


PENGAMBILAN, PENYIMPANAN DAN PENGIRIMAN SPESIMEN UNTUK PEMERIKSAAN
 INFEKSI DENGUE (DBD)

Definisi demam berdarah
Penyakit Demam Berdarah Dengue (DBD) adalah penyakit menular yang disebabkan oleh virus dengue dan ditularkan oleh nyamuk Aedes aegypti, yang ditandai dengan demam mendadak dua sampai tujuh hari tanpa penyebab yang jelas, lemah/lesu, gelisah, nyeri hulu hati, disertai tanda perdarahan dikulit berupa petechie, purpura, echymosis, epistaksis, perdarahan gusi, hematemesis, melena, hepatomegali, trombositopeni, dan kesadaran menurun atau renjatan.Virus ini termasuk dalam grup B Antropod Borne Virus (Arboviroses) kelompok flavivirus dari family flaviviridae, yang terdiri dari empat serotipe, yaitu DEN 1, DEN 2, DEN 3, DEN 4.
Demam Berdarah Dengue adalah salah satu penyakit di daerah tropis yang ditularkan oleh nyamuk Aedes aegypti (betina). Nyamuk ini adalah nyamuk rumah yang menggigit pada siang hari, gigitan nyamuk itu sendiri lebih dari satu kali. Demam Berdarah hanya ditularkan melalui nyamuk Aedes aegypti (betina) yang berkembang biak di dalam air jernih di sekitar rumah, bukan di got / comberan yang berair kotor. Protein yang terkandung di dalam darah diperlukan oleh nyamuk betina untuk perkembangbiakan (produksi) telurnya. Virus dengue penyebab DBD termasuk famili Flaviviridae, yang berukuran kecil sekali, yaitu 35-45 mm.
Tujuan pengambilan spesimen infeksi dengue
Tujuan dari pengambilan sampel pada infeksi Dengue adalah untuk mengumpulkan sebagian bahan dalam volume yang cukup kecil yang akan diperiksa secara tepat / teliti untuk dapat dibawa dengan mudah dan diperiksa di laboratorium. Pemeriksaan serologis untuk mendeteksi antibodi terhadap infeksi virus dengue makin berkembang saat ini, hal tersebut disebabkan karena rumit dan lamanya waktu yang diperlukan untuk isolasi virus yang merupakan diagnosis pasti, dengan menggunakan kultur sel. Disamping isolasi virus dengan kultru sel, teknik Polymerase Chain Reaction untuk deteksi antigen dengue juga berkembang pesat, namun kedua uji ini membutuhkan peralatan yang mahal dan kurang cocok untuk negara berkembang.


Tata Cara pemeriksaan spesimen infeksi dengue
Pemeriksaan spesimen dilakukan melalui 4 tahap yaitu  :
Tahap 1 Pengambilan
Tahap 2 Pengolahan
Tahap 3 Penyimpanan
Tahap 4 Pengantaran  spesimen/pengiriman
Jenis Spesimen Untuk Pemeriksaan Dengue
1. Spesimen darah akut (s1)
2. Spesimen darah konvelesen (s2&s3)
3. Jaringan
Waktu Pengambilan Spesimen Infeksi Dengue
Pengambilan spesimen  dilakukan 2 -3 kali :
            1. Spesimen Darah Akut (S1)                      yaitu         0-5 hari setelah onset
2. Spesimen Darah Konvelesen (S2&S3)    yaitu         2-3 Minggu Setelah Awitan
3.  Jaringan                                                   yaitu         Secepatnya setelah Meninggal
Metode penggunaan microtiter untuk pengambilan spesimen infeksi dengue
Pada HI test ini mula-mula dipakai satu macam antigen  yang mempunyai reaksi yang luas (Dengue I atau Dengue 4). Apabila tes menunjukkan negatif, tes diulang kembali dengan  mempergunakan antigen-antigen yang lain. Specimen akut dan  konvalesen harus dites bersama-sama
a. Uji hemaglutinasi inhibisi (uji HI) merupakan salah satu pemeriksaaan serologi untuk penderita DBD dan telah ditetapkan oleh WHO sebagai standar pada pemeriksaan serologi penderita DBD dibandingkan pemeriksaan serologi lainnya seperti ELISA, uji komplemen fikasi, uji netralisasi, dan sebagainya.
b. Apapun Jenis uji yang dilakukan, konfirmasi serologis sudah pasti bergantung pada kenaikan yang signifikan (4 kali lipat atau lebih) pada antibodi spesifik dalam sampel serum diantara fase akut dan fase pemulihan. Kumpulan antigen untuk sebagian besar uji serologis ini harus mencakup keempat serotipe dengue .
Pemeriksaan Serologi Pengumpulan Spesimen Darah infeksi dengue
1.  Penggunaan kertas saring (filter paper khusus).
a. Darah diteteskan pada kertas saring sampai jenuh, bolak-balik sehingga seluruh permukaan filter paper terisi darah rata.
b. Darah dapat dari pembuluh vena dapat pula darah dari ujung jari (ujung jari ditusuk).
c.  Kertas saring yang berisi darah dibiarkan kering pada temperatur kamar.
d. Jangan dikeringkan dengan panas sinar matahari atau yang lainnya.
e. Kertas saring yang berisi darah yang telah kering disimpan dalam tempat yang kering pada suhu kamar tidak lebih dari 3 bulan.
f. Kirimkan dalam amplop atau kantong plastik ke laboratorium secepatnya sebelum waktu 3 bulan tersebut.
2.  Penggunaan Serum
a. Darah diambil secara asepsis 2-6 cc darah venous dengan menggunakan semprit.
b.  Serum dipisahkan dengan diputar 1500-2000 putaran sekitar 10-15 menit. Serum yang terpisah
c. Dipindahkan dalam botol kecil dengan menggunakan pipet Pasteur.
d. Serum tersebut disimpan pada suhu -20 C sebelum dikirim ke laboratorium.
Cara ini merupakan cara yang terbaik, tetapi bila diingat bahwa pengumpulan serum serum memerlukan alat-alat khusus (semprit steril, lemari es, sentrifuse, pipet Pasteur steril, termos es dll.), maka cara kedua adalah lebih tepat.  Hasil yang diperoleh dengan menggunakan kertas saring adalah cukup baik, terutama apabila cara pengisian dilakukan dengan betul
3. Blot IgG dan IgM
Tes serologi lainnya adalah dengue blot IgG dan IgM. Dengue blot IgG masih banyak kelemahannya. Sensitivitas pada infeksi sekunder tinggi, tetapi pada infeksi primer sangat rendah. Hasil positif IgG menandakan adanya infeksi sekunder dengue. Tetapi bisa juga dibaca sebagai pernah terkena infeksi virus dengue.  Untuk IgM sensitivitasnya lebih baik, khususnya untuk infeksi primer dengue. Sayang harganya relatif lebih mahal. Tes ini merupakan pemeriksaan kualitatif dengan mempergunakan metode enzyme immunoassay. Dengan tes ini, antibodi IgM baru dapat diketahui setelah hari ke-5 infeksi dengue. Uji ini merupakan salah satu tes pilihan untuk diagnosis infeksi dengue akut, baik primer ataupun sekunder, dengan melihat terdeteksinya kadar IgM anti-dengue pada serum tunggal. Sedangkan dengan terdeteksinya IgG anti-dengue dapat dipakai untuk melihat apakah infeksi tersebut primer atau sekunder, tergantung dari standarisasi masing-masing reagen yang telah ditetapkan setara berapa kadar HI-nya.
4. Dengue IgG dan IgM Capture ELISA
Tes lainnya yang beredar adalah Dengue IgG dan IgM Capture ELISA (Enzymelinked Immunosorbent Assay). Pemeriksaan ini memerlukan waktu 90 menit untuk IgM dan 60 menit untuk IgG. Hasilnya dapat keluar sebagai kadar dari IgG dan IgM (kuantitatif).
Dengue blot/Dengue Stick/Dot imunoasai Dengue merupakan teknik yang baru dikembangkan dan merupakan uji serologis dengue yang banyak dipakai saat ini. Uji ini dipakai untuk mendeteksi adanya antibodi yang reaktif terhadap virus dengue serotipe 1, 2, 3 dan 4 dalam plasma atau serum penderita yang dicurigai menderita demam dengue/DBD.
Prinsip dasar uji Dengue blot/Dengue Stick/Dot imunoasai Dengue adalah uji ELISA, baik uji ELISA tak langsung (indirect ELISA) atau menggunakan Captured-ELISA. Yang membedakan uji Dengue blot/Dengue Stick/Dot imunoasai Dengue dibandingkan dengan ELISA yaitu pada fase padatnya, menggunakan kertas nitroselulose yang bersifat high capacity.
Pada uji Dengue blot/Dengue Stick/Dot imunoasai Dengue dapat menggunakan metode ELISA tak langsung yaitu antigen virus dilekatkan langsung pada fase padat, dimana setelah diberikan blokade untuk menutup celah-celah diantara antigen pada kertas nitroselulose, langsung diberikan serum penderita. Bila didalam serum penderita terdapat antibodi anti-dengue dapat berupa IgG anti-dengue atau IgM anti-dengue, yang dikerjakan secara terpisah yaitu IgG indirect ELISA saja atau IgM indirect ELISA, maka antibodi tersebut akan berikatan dengan antigen yang terikat pada kertas nitroselulose. Setelah tahap inkubasi dan pencucian, ikatan antigen-antibodi ini dapat dilacak dengan menggunakan konjugat yaitu antibodi yang berlabel enzim AP (alkalinefosfatase), HRP (horseradish peroxidase) maupun colloidal gold yang akan memberikan dot berwarna biru keunguan setelah ditambah substrat berkromogen.
Selain dengan metode ELISA tak langsung, uji ini dapat dilakukan dengan menggunakan metode Captured ELISA, misalnya pada IgM Captured ELISA dimana antihuman IgM dilekatkan pada fase padat kertas nitroselulose. Antihuman IgM ini akan menangkap IgM didalam serum penderita. Tahap berikutnya diberikan antigen dengue, selanjutnya diberikan pelacak seperti yang terdapat pada metode ELISA tak langsung diatas dan akan memberikan hasil dot berwarna biru keunguan yang menunjukkan hasil positif.
Uji Dengue blot/Dengue Stick/Dot imunoasai Dengue yang saat ini banyak digunakan di Indonesia adalah Dengue blot/Dengue Stick IgG, dengan metode ELISA tak langsung. Pada penelitian yang dilakukan oleh Pokja DBD LPUI, 1995, dengan membandingkan Dengue Stick IgG  buatan dalam negeri (PT. Kalbe Farma) dan Dengue blot IgG, didapatkan hasil pada infeksi primer, dengan menggunakan serum akut saja kedua uji ini menunjukkan hasil negatif sebesar 82,8% dan 93,2%, yang seharusnya kedua uji ini harus 100% negatif, karena infeksi primer serum akut belum mempunyai IgG. Baru pada serum konvalesen, didapatkan hasil 72,4% positif untuk Dengue blot IgG dan 68,9% positif untuk Dengue Stick IgG.
Pada infeksi sekunder, dengan serum akut didapatkan hasil positif 66,6% untuk Dengue blot IgG dan 64,4% untuk Dengue stick IgG. Sedangkan pada serum konvalesen hasil positif didapatkan naik menjadi 100% untuk Dengue blot IgG dan 97,8% Dengue stick IgG. Disini tampak banwa Dengue blot IgG maupun Dengue stick IgG mempunyai sensitivitas yang sama, dimana dengan memeriksa serum konvalesen sensitivitas keduanya dapat ditingkatkan baik untuk infeksi primer maupun sekunder.
Senada dengan pendapat Yatim, 1996, uji Dengue stick IgG sensitivitasnya tinggi untuk infeksi dengue sekunder dengan serum akut, sedangkan infeksi primer sensitivitasnya rendah pada serum akut.
Waktu pengerjaan Dengue stick IgG adalah 2,5 jam, dengan biaya yang relatif tidak mahal karena memakai bahan lokal. Sedangkan untuk Dengue stick IgM memakai metode IgM Captured ELISA, dengan waktu pengerjaan 5,5 jam pada suhu 37 0C dan 23 jam pada suhu ruang, dengan biaya yang lebih mahal karena masih memakai reagen impor.
Saat ini juga sudah dikembangkan uji dot imunoasai (Agus Sjahrurachman, 2000) untuk deteksi IgM anti-dengue, dengan metode IgM Capture ELISA dengan nama BDIA (Biotinylated Dengue Immunoassay) menggunakan antigen biotinylated-dengue virus dan pelacak HRP-labelled Streptavidin dan substrat 5-chloronaphtol yang memberikan hasil dot berwarna ungu pada serum positif, dengan cut off value absorbans lebih besar atau sama dengan 0,11. Sensitivitas lebih tinggi untuk infeksi dengue sekunder, tetapi rendah pada infeksi primer, juga pada serum konvalesen lebih tinggi kadarnya dibandingkan serum akut. Yang mengejutkan adalah adalah juga ditemukan IgM anti-dengue dengan kadar rendah pada kelompok non-dengue, dimana kemungkinan penderita ini pernah terpapar virus dengue dan masih dalam fase konvalesen. Waktu pengerjaan 4,5 jam. Dot imunoasai ini belum dipasarkan secara luas.
Pada penelitian Wu SL, 2000, diteliti sensitivitas IgM dipstick ELISA dengan metode ELISA indirek, menggunakan antigen Dengue2, dengan waktu pengerjaan 75 menit dibandingkan dengan Immunochromatographic card assay, dengan antigen tetravalent (campuran D1, D2, D3, D4) untuk deteksi IgM dan IgG anti-dengue. Hasil IgM dipstick ELISA bila positif juga berupa dot berwarna biru keunguan. Kedua tes memiliki spesifisitas dan sensitivitas yang bagus yaitu > 90% untuk deteksi IgM anti-dengue.
Pemeriksaan Rumple leed test
Percobaan ini bermaksud menguji ketahanan kapiler darah dengan cara mengenakan pembendungan kepada vena-vena, sehingga darah menekan kepada dinding kapiler. Dinding kapiler yang oleh suatu sebab kurang kuat akan rusak oleh pembendungan itu, darah dari dalam kapiler itu keluar dari kapiler dan merembes ke dalam jaringan sekitarnya sehingga nampak sebagai bercak merah kecil pada permukaan kulit (petechiae).
Tata cara :
·         Pemeriksaan dilakukan dengan memasang sfigmomanometer pada lengan atas dan pompa sampai tekanan berada ditengah-tengah nilai sistolik dan diastolik.
·         Pertahankan tekanan selama 10 menit, setelah itu lepaskan ikatan dan tunggulah sampai tanda-tanda stasis darah lenyap lagi.
·          Stasis darah telah berhenti jika warna kulit pada lengan yang dibendung tadi mendapat lagi warna kulit lengan yang tidak dibendung.
·         Lalu carilah petechiae yang timbul dalam lingkaran berdiameter 5 cm kira-kira 4 cm distal dari vena cubiti.
·         Test dikatakan positif jika terdapat lebih dari 10 petechiae dalam lingkaran tadi.
Isolasi Virus infeksi dengue
Isolasi sebagian besar strain virus dengue dari spesimen klinis dapat dilakukan pada sebagian besar kasus asalkan sampel diambil dalam beberapa hari pertama sakit dan langsung diproses tanpa penundaan. Spesimen yang mungkin sesuai untuk isolasi virus diantaranya serum fase akut dari pasien, autopsi jaringan dari kasus fatal, terutama dari hati, limpa, nodus limfe.
Tata Cara Pemberian Label Pada Pengambilan Spesimen Infeksi Dengue
Memuat Identitas penderita, yang meliputi
ü  Nama
ü Umur
ü  Jenis Kelamin
ü  Jenis permintaan
ü pemeriksaan/biakan apa
ü  Jam dan Tanggal pengambilan spesimen
ü  Jika sampel > 1 per Px, beri tanda:
     ‘1 dari 3’,
     ‘2 dari 3’,
     3 dari 3’.
Penyimpanan spesimen infeksi dengue
1. Spesimen darah Akut (S1)     disimpan Pada Suhu   - 700 C
2. Spesimen darah Konvelesen (S2 & S3) disimpan Pada Suhu -20 0C
3. Jaringan  disimpan Pada Suhu  -70 0C

Pengiriman spesimen infeksi dengue
1. Spesimen darah Akut (S1)    Dry-ice
 2. Spesimen darah Konvelesen (S2 & S3)  Beku/Es
3.  Jaringan    Dry-es
Hal yang perlu di perhatikan dalam pengambilan spesimen infeksi dengue
1. Filter tidak jenuh/penuh di seluruh permukaannya.
2. Filter yang berisi darah belum sepenuhnya kering, sehingga  waktu dimasukkan dalam kantong plastik dan dikirim menjadi  busuk.
3. Kertas filter yang berisi darah dikeringkan secara tergesa gesa,  dengan panas dari sinar matahari/lampu dan sebagai nya



2 komentar:

  1. note : bukan pengiriman bukan - 70,,dll,,tp sktr suhu 28

    BalasHapus
  2. sumber nya dari mana??
    yang rumple leed dengan pertahankan tekanan 10 menit drmana?

    BalasHapus